服务简介
背景：创新抗体药研发过程中，原材料制备是药物研发第一环节，为了克服原材料中细胞株制备周期长、通量小、成功率低的缺陷，三优隆重推出研究用过表达细胞株构建服务。
方法：通过电转、化转及慢病毒感染等方式在CHO、HEK293及多种肿瘤细胞上构建过表达细胞株，并通过puromycin、hygromycin、G418及GS高表达筛选系统层层筛选，获得稳定高表达细胞株。
优势：仅需4-6周（转染开始），即可获得表达量高、稳定性好的过表达细胞池，6-8周可获得单克隆细胞株，且每次可同时批量构建30个细胞株。
案例：截止2022年4月，三优生物研究用细胞株构建平台已经完成上百个项目，覆盖分泌型抗原、抗体、膜蛋白及跨膜蛋白过表达细胞株，在CHO、HEK293及jurkat等多种细胞上成功构建过3000+过表达细胞株，90%细胞株能够稳定传代20个PDL。
服务亮点
适配多类型细胞株构建
可灵活选择各种靶点类型、物种类型；以多种方式在CHO、HEK293及肿瘤细胞上进行稳定细胞株构建，同时可个性化构建luci报告系统细胞株。
稳定性和质量全面保障
系统全面的体外药效验证搭载经验丰富的专业化团队，超3000+成功经验积累，配合三优系统完善质控体系保障，保证交付质量。
极速的一站式交付体验
采用高通量与自动化模式搭配规范的流程化项目模式，经三优系统完善的质控体系保障了数百个靶点的成功交付，保证客户满意，4-6周即可完成构建。
服务内容
服务流程
服务特性
1. 人源化程度高
三优研究用细胞株平台目前针对多种细胞系均建立完善的细胞株构建工艺，可用于免疫、筛库及功能评价，过表达细胞株可批量化生产，4-6周即可交付质检合格的稳定过表达细胞株。
4种来源清晰，经过严格质控的GMP宿主细胞可供选择，包括Thermo授权的Freedom CHO-S, Horizon授权的HD-BioP3 Null CHO K1S，Merck授权的CHOZN与QuaCell授权的CHO-K1Q等，三优生物已针对不同宿主细胞开发了成熟的细胞株构建工艺。
2. 超过20个PDL稳定性评估，确保阳性率＞80%
在克隆筛选阶段对12-24个克隆细胞株进行早期表达量评估，初步确定优选克隆后，对建库细胞进行20个 PDL的稳定性评估，确保细胞库稳定性满足研究所需。
稳定性评估内容及标准
3. 团队成员经验丰富
三优研究用细胞株平台目前已累计构建3000+过表达细胞株，成功率高达98%，其中85%以上过表达细胞株一次性构建阳性率达到80%以上；可灵活定制个性化靶点的Luciferase reporter system，并通过相关Assay进行功能验证。
细胞株数量
4. 多重筛选保证最优克隆
分泌型细胞株：基于板式反应器、管式反应器、摇瓶、发酵罐等多重筛选体系，1000+克隆采用3轮Batch和3-4轮Fed batch逐步淘汰，确保获得高表达、稳定细胞株。
过表达细胞株（膜蛋白/跨膜蛋白）:基于96孔板、24孔板、12孔板、6孔板等多重筛选体系，qPCR和FACS层层筛选淘汰，确保获得高表达、稳定细胞株。
管式反应器
小型反应器
摇床
ABI 7500 Fast QPCR仪
流式细胞仪
案例展示
1. 过表达细胞株构建
1.1 CHO细胞过表达细胞株鉴定数据
目的：在CHO细胞上构建过表达膜蛋白，用于筛库及功能验证。
方法：通过电转法将目的基因导入细胞，GS筛选系统两轮筛选，获得稳定过表达细胞株。
结果：过表达细胞株表达量较空细胞提高十万倍左右，且阳性率为99.9%。
结论：此过表达细胞株构建成功。
Fig. 2 CHO-S细胞过表达细胞株FACS鉴定结果
1.2 HEK293细胞过表达细胞株鉴定数据
目的：在HEK293细胞上构建过表达膜蛋白，用于筛库及功能验证。
方法：通过电转法将目的基因导入细胞，Puromycin两轮筛选，获得稳定过表达细胞株。
结果：过表达细胞株表达量较空细胞提高十万倍左右，且阳性率为99.7%。
结论：此过表达细胞株构建成功。
Fig. 3 HEK293 细胞过表达细胞株FACS鉴定结果
1.3 肿瘤细胞过表达细胞株鉴定数据
目的：在肿瘤细胞jurkat上构建过表达膜蛋白，用于筛库及功能验证。
方法：通过慢病感染将目的基因导入细胞， Puromycin两轮筛选，获得稳定过表达细胞株。
结果：过表达细胞株表达量较空细胞提高万倍左右，且阳性率为100%。
结论：此过表达细胞株构建成功。
Fig. 4 jurkat 细胞过表达细胞株FACS鉴定结果
2. 荧光素酶报告基因细胞株
2.1 PD-1/PD-L1 Luciferase reporter system
本报告基因细胞株体系采用2个细胞株，效应细胞株以Jurkat细胞作为宿主细胞，过表达人PD-1受体蛋白和NF-AT-LUC2反应原件，通过Puromycin和Hygromycin抗性基因筛选的单克隆细胞；aAPC细胞株以CHO-S细胞为宿主细胞，表达αCD3 ScFv抗体和PD-L1蛋白在细胞膜上。
Fig. 5 PD-L1荧光素酶报告基因检测体系原理示意图
Fig. 6 αPD-1/PD-L1拮抗剂抗体激活TCR信号
2.2 VEGF/VEGFR2 luciferase reporter cell line
本报告基因细胞株体系采用HEK293细胞作为宿主细胞，过表达人VEGFR2受体蛋白和NF-AT-Luc2反应原件，通过Puromycin和Hygromycin抗性基因筛选得到的单克隆细胞。
Fig. 7 VEGFR2荧光素酶报告基因检测体系原理示意图
Fig. 8 重组人VEGF蛋白激活荧光素酶报告基因系统
Fig. 9 贝伐珠单抗中和重组人VEGF蛋白
3. 分泌型稳定细胞株构建
3.1 表达量分析
目的：通过Bulk pool方法构建分泌型稳定过表达细胞池，用于克级蛋白生产。
方法：通过电转法将目的基因导入细胞，GS筛选系统加压筛选，获得稳定过表达细胞池。
结果：对39个项目的细胞池摇瓶期表达量进行统计，平均表达量为2.2 g/L，多个细胞池表达量高于3.0 g/L。
结论：通过Bulk pool方式构建的过表达细胞池可在35天左右获得克级蛋白 。
Fig. 10 细胞池表达量分析
3.2 细胞池Fed-batch培养过程检测
目的：检测细胞表达过程各种参数指标，综合评估蛋白表达量及表达稳定性。
方法：细胞池接种到培养基中进行摇瓶Fed-batch培养，定期取样，检测活细胞密度、细胞活率、表达量以及乳酸、葡萄糖等代谢数据。
结果：细胞株活细胞密度最高可到2.5E+7 cells/mL，培养14天后，细胞活率仍可维持在70%以上，抗体表达量可达3.4 g/L，乳酸始终维持在相对较低水平。
结论：细胞在表达过程中各项指标均符合规范要求。
Fig. 11 细胞池Fed-batch培养
科研成果
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